因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法
根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考GB/T 23527-2009 附录B中福林酚法进行，即1个酶活力单位（U/mL）定义为1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5条件下反应1 min水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制
（1）L-酪氨酸标准溶液：按表2-6配制。
表2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form
管号
酪氨酸标准溶液的浓度/
（μg/mL）
取100 μg/mL酪氨酸标准溶液的体积/（mL）
取水的体积/ （mL）
0 1 2 3 4 5 0 10 20 30 40 50 0 1 2 3 4 5 10 9 8 7 6 5
（2）分别取上述溶液各1.00 mL，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL，福林试剂使用
液1.00 mL，置于40 ℃ ± 0.2 ℃水浴锅中显色20 min，用分光光度计于波长680 nm，10 mm比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸浓度C为横坐标，绘制L-酪氨酸标准曲线。
图2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve
根据作图或用回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K值。其K值应在95-100范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法
（1）计算方法
X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g；
A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数；
4 —反应试剂的总体积，mL；
10—反应时间10 min，以1 min计； n —稀释倍数。 （2）测定方法
① 先将干酪素溶液放入40 ℃ ± 0.2 ℃恒温水浴中，预热5 min。 ② 按下列程序操作，进行测定。
于680 nm波长，用10 mm比色皿测其吸光度。
试管A（空白） 试管B（样品） 酶液1.00 mL 预热2 min
酶液1.00 mL 预热2 min 三氯乙酸2.00
mL 混匀 保温10 min
干酪素1.00 mL 混匀 保温10 min 干酪素1.00 mL
混匀 三氯乙酸2.00 mL
混匀
10000 r/min 离心2 min 10000 r/min 离心2 min
滤液1.00 mL 加碳酸钠溶液5.00
mL 滤液1.00 mL 加碳酸钠溶液5.00 mL
加福林试剂1.00 mL
显色20 min
加福林试剂1.00 mL 显色20 min
角蛋白酶活力的测定
1、角蛋白酶活力测定方法
试剂和溶液：
a. 硼酸缓冲溶液（pH 10.5）：称取硼酸钠9.54 g，氢氧化钠1.6 g，加水至900 mL，搅拌均匀。用1 mol/L 盐酸溶液或0.5 mol/L 氢氧化钠溶液调整pH=10.5±0.05，
定容至1000 mL。
b. 硼酸缓冲溶液（pH 9.5、11.5）：称取硼酸钠9.54 g，加水至800 mL，用氢氧化钠溶液调整pH=9.5±0.05或pH=11.5±0.05，定容至1000 mL。 c. 10%三氯乙酸：10 g三氯乙酸，加水至100 mL。
d. 0.5%羊毛角蛋白溶液：取0.5g羊毛角蛋白加入100ml硼酸缓冲液溶解 测定方法：
取1 mL酶液（0.1 g酶粉用对应pH缓冲液溶解离心，取上清液适当稀释），取4支具塞试管中，空白加1mL酶液、2 mL 0.5%羊毛角蛋白溶液（pH10.5、硼酸缓冲液溶解）、2 mL 10 %三氯乙酸，对照加入1ml酶液和2ml角蛋白溶液，在40℃恒温水浴锅中反应1 h后对照加2 mL 10 %三氯乙酸终止反应，在10000 r/min离心10 min，取上清液，过滤，在280 nm处测吸光度。（使用石英比色皿）
酶活定义：1 ml/1 g酶在该反应体系下对照相对于空白样A280nm吸光每升高0.01为1 unit（U）。X=(A280-A0)×100×N
N为稀释倍数
胶原蛋白酶活力的测定
标曲的绘制
取11支试管分别标号，向每支试管中分别加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 mL 的0.75umol/ml 的标准甘氨酸溶液，并用水补足至0.5 mL，各加入0.5 ml乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）充分混合，最后加入0.5m L 茚三酮显色液，充分混合。用试管盖盖住，在100℃下水浴加热10 min，冷却放置10min，加入4.5 mL乙醇（60%，v/v）进行稀释，在570nm 下比色。
吸光值与甘氨酸浓度标准曲线
10.90.80.7y = 1.2122x + 0.0135R² = 0.9955OD-570nm0.60.50.40.30.20.1000.10.20.30.40.50.60.70.8Gly-umol/ml y=1.2122x+0.0135
酶活X=55.7359×N×(OD-0.0135)
酶活力测定
发酵粗酶液12000rpm/min离心10分钟取上清（固体酶粉酶活测量时，取酶粉取0.1 g，加入适当硼酸缓冲液（pH 10.5）溶解并在旋涡混匀器混匀3 min直至无明显固体团,并用硼酸缓冲液（pH 10.5）适当稀释一定倍数，分别取0.5 mL稀释后的酶液于4支试管中，将所需I 型胶原和酶液于37℃下保温五分钟，然后向空白样中加入0.5 mL的Ι型胶原（5 mg/mL，底物溶于水中）和0.5 ml的TCA，对照样中加入0.5 ml I型胶原，混匀，37 ℃，40 min，之后对照中加入0.5 mL 0.4 M的三氯乙酸终止反应。取1 ml反应后的液体于12000rpm/min离心2min，取上清0.5 mL，加入0.5ml乙酸-乙酸钠缓冲液（2 mol/L，pH 5.4），最后加入0.5 ml 1%的茚三酮显色液，将试管封塞混匀，于100 ℃下水浴加热10 min，冷却10min，加入4.5 ml60%乙醇稀释于570nm以空白为零测定吸收值。
根据甘氨酸标准曲线计算出酶活力大小。
酶活力定义：37 ℃，pH 7.5条件下，每分钟每毫升发酵液水解胶原产生1 μg甘氨酸为一个酶活力单位。
（1）三氯乙酸溶液（0.4 mol/L）：准确称取三氯乙酸65.4 g，用水溶解并定容至1000 mL。
（3）氢氧化钠溶液（0.5 mol/L）：称取20 g NaOH，用水溶解并定容至1000 mL。
（4）60%乙醇：量取无水乙醇60 mL 加水定容到100 mL，待用。
（5）Ι型胶原溶液：取500 mg I型胶原溶于100 mL磷酸缓冲液（pH 7.5）中，4 ℃避光保存。
（6）0.75 μmol/mL甘氨酸标准液：称取0.2252 g甘氨酸溶解后定容到100 mL得到30 umol/ml的甘氨酸溶液，之后取0.5ml加4.5 ml水混匀稀释10倍，再从混匀后的溶液中取3 ml加入9 ml水混匀稀释4倍，得到0.75 umol/ml的甘氨酸标准溶液。
（7）茚三酮显色液：称取0.85 g茚三酮二水与0.15 g还原茚三酮二水溶于90ml
乙二醇单甲醚，定容100ml。
（8）2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.4）：82.7 mL 2 mol/L乙酸钠与17.3 mL 2 mol/L乙酸混匀。
（9）2 mol/L乙酸钠溶液：称取82 g无水乙酸钠溶于500 mL水中。 （10）2 mol/L乙酸：量取12.01 g冰乙酸加水定容至100 mL。
弹性蛋白酶活力的测定
采用Sacher3方法并参照中国现行药用弹性蛋白酶测定方法进行。称取10 mg刚果红-弹性蛋白于试管中，加2 mL pH值7.4、0.2 mol/L硼酸缓冲液，取1 mL适当稀释酶液(固体酶粉酶活测量时，取酶粉取0.5 g，加入10 ml硼酸缓冲液溶解震荡溶解2 min，12000rpm/min 离心2 min，用硼酸酸缓冲液（pH 7.4）适当稀释一定倍数)于37 ℃下振荡反应20 min，加入pH值6.0、0.2 mol/L 磷酸钠缓冲液2 mL终止反应，离心过滤后取上清液测495 nm光密度，以不加酶液和底物的反应系统为空白。在此反应条件下溶解1 mg刚果红-弹性蛋白底物所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位（U）。参照Sacher方法绘制弹性蛋白酶标准曲线.
y=0.2109x（mg/ml） X=1.1854xODxN （1）0.2M硼酸缓冲液(pH 7.4)：取19.07 g硼砂（Na2B4O7·10H2O, MW 381.37）溶于水定容1 L，配置成A液，取12.37 g硼酸（H3BO3 ,MW 61.83）溶于水定容1 L，配置成B液，取两种液体以A:B=1:9的比例混合并适当调节pH至7.4。
（2）0.2 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 6.0）: 0.2M磷酸缓冲液（pH 7.5）：取71.63 g十二水磷酸氢二钠溶于水并定容1L水中，配置成A液，取7.8 g二水磷酸二氢钠溶于水并定容于250 ml水中，配置成B液，A液与B液以 比例混合，并用适当的A液和B液适当微调pH至pH 6.0
以下说说我在碱性蛋白酶活力测定过程中出现的问题和解决方法
首先我在多次测定碱性蛋白酶酶活力的过程中发现样品酶活力差异较大，甚至同一个样品酶活力也有20%-240%的大小差异，这使得我陷入思考，为什么会这样，我经过多次测定酶粉时的碱性蛋白酶活力发现同一个样品在不同稀释倍数下有不同的OD值，理论上讲同一个样品不管怎么稀释，只要OD在0.2-0.8范围内时应该根据酶活力计算公式X=4*A*N*K/10计算的结果应该无显著差异的，但是结果与预料中的不一致，以下是我选取一个碱性蛋白酶样品的酶粉，稀释不同的倍数，呈现不同的OD值，最后计算的酶活力，根据计算，发现其中的规律。
首先是同一个样品在不同的稀释倍数下的OD变化
AX0.4
0.834000AX320000.6300000.428000A0.2260000.001000200030004000500060007000240008000N0.8AX26000240000.622000X
20000180000200040001600060000.20.0NA代表的OD680的对照对于空白的吸光值，X代表了碱性蛋白酶的酶活力，理论上随着稀释倍数增大，酶活力应该不会变化太大，结果却显示发现随着稀释倍数增大酶活力先增大后趋于稳定。
后来发现溶液OD在0.2-0.4附近时酶活变化幅度较小，此时测定酶活力误差较小，当OD低于0.1时酶活又会急剧增加，高OD值时碱性蛋白酶酶活力偏低原因在于当溶液酶浓
度过高时，根据米氏方程，决定酶促反应的动力学中，酶处于过量状态，此
时为零级反应，应速率受限于底物浓度，反应速率低于最大速率Vmax，随着反应进行，底物急剧消耗，底物浓度降低较快，而酶在10分钟之内并未损失太多，因此实际测量过程中当酶浓度较高时反而误差会较大，同时酪蛋白被酶水解后水解物中产生多种氨基酸，含有酚基氨基酸与福林试剂显色影响测量结果，同时受限于分光光度计的检测原理，过高或过低的OD会使得其检测时产生较大误差。
对于碱性蛋白酶活力测定过程中的繁琐与反复稀释，同时酶稳定性的原因，无论是放置于保鲜冰箱或低温冰箱都会使得酶活力有较大程度的衰减，因此快速的碱性蛋白酶活力测定需要确立，对于已经干燥的酶粉或少量样品，基于其碱性蛋白酶活力测定，通过反复多次稀释并控制稀释后酶液的酶活力使得显色OD处于合理的大小会得到相对准确一些的酶活力值。但对于大量样品需要急测且并无太多时间与人力物力反复测定，且酶液随着从无菌容器取出，酶活力会快速衰退，因此快速简便准确测定同批次与不同批次、酶活力或存在较大差异样品需要测定，事物存在具有一定规律，酶促反应动力学中除开仪器、显色剂、样品本身纯度等系统误差，吸光值与稀释倍数存在一定的函数关系，因此模拟出比较适合的函数关系可通过一次简单试验短时间内确定最优稀释倍数使得稀释后酶液酶活力处于较好大小，由米氏方程实际意义，底物蛋白过量时反应为一级反应，反应速率与酶浓度线性关系较好，吸光值OD与稀释倍数N呈现反比例函数关系，当稀释后酶液浓度过大时，反应速率逐渐减少，减少的时的反应速率在先前基础上倍级减少，此时较为符合幂函数方程，实际测量时，酶活力X-N关系应为上升的阶梯式曲线，而适当的OD选取范围处于阶梯水平处，至于A-N关系根据以往碱性蛋白酶酶活力测定经验与米氏方程及实际反应过程中的情况，其关系曲线与幂函数较为符合，对于X-A-N的关系，以选定的A-N为例，
AA26000X0.80.8
240000.60.6
22000
0.40.4
20000
0.20.218000
160000.00.00200040006000010002000300040005000
NN 26000XX 25000 24000
22000
20000 20000
18000
15000 16000AXX020004000X60000.0N0.20.40.60.8NA
选取不同函数拟合，对比不同函数拟合效果与实际酶反应动力学意义，因此选单指数函数拟合
2000 2000 20000.70.60.50.40.30.20.10.001000 A Sheet1列B的Cubic 拟合模型方程绘图ABCDReduced Chi-SqrR平方(COD)调整后R平方Cubicy = A + B*x + C*x^2 + D*x^3A1.08886 ± 0.09947-5.44893E-4 ± 1.0036E-41.06119E-7 ± 2.82238E-8-6.91667E-12 ± 2.33126E-120.001170.984140.968270.70.60.50.40.30.20.1模型方程绘图y0xcwAReduced Chi-SqrR平方(COD)调整后R平方 A 总表列B\"A\"的Gauss 拟合Gaussy=y0 + (A/(w*sqrt(pi/2)))*exp(-2*((x-xc)/w)^2)A0.12772 ± 0.02725-21012.92442 ± 188455.6548510357.41222 ± 43236.38765.70709E7 ± 4.76549E97.03688E-40.990490.98098AA30004000500060007000800090001000200030004000500060007000N A Sheet1列B\"A\"的多项式拟合0.70.60.50.40.30.20.1模型方程绘图y0A1t1Reduced Chi-SqrR平方(COD)调整后R平方N0.70.60.50.40.30.20.11000方程绘图权重截距B1B2B3B4残差平方和R平方(COD)调整后R平方y = Intercept + B1*x^1 + B2*x^2 + B3*x^3 + B4*x^4A不加权1.37643 ± 0.10478-0.001 ± 1.544E-43.25792E-7 ± 7.16857E-8-4.75833E-11 ± 1.30592E-112.54167E-15 ± 8.1288E-165.98095E-40.997310.99192 A 总表列B\"A\"的ExpDec1 拟合ExpDec1y = A1*exp(-x/t1) + y0A0.12447 ± 0.014581.22212 ± 0.127431192.14473 ± 141.122334.59586E-40.991720.98758A30004000500060007000AN A Sheet1列B\"A\"的多项式拟合方程绘图权重截距B1B2B3B4B5残差平方和R平方(COD)调整后R平方y = Intercept + B1*x^1 + B2*x^2 + B3*x^3 + B4*x^4 + B5*x^5A不加权0.04105 ± 0.003830.00158 ± 3.52679E-5-1.32577E-6 ± 4.07777E-84.22369E-10 ± 1.61478E-11-5.86554E-14 ± 2.62561E-152.97297E-18 ± 1.50051E-191.02667E-40.999540.997231000200030004000500060007000N0.80.70.60.5模型方程绘图y0A1t1Reduced Chi-SqrR平方(COD)调整后R平方ExpDec1y = A1*exp(-x/t1) + y0A0.1203 ± 0.009031.03982 ± 0.017261233.04048 ± 45.698786.16924E-50.998950.998660.70.60.50.40.30.20.11000 A Sheet1列F\"A\"的ExpDec1 拟合A A0.40.30.20.1100060007000300040005000N2000300040005000N
最终选取其中单指数函数ExpDec 1进行拟合，最终拟合函数模型 ExpDec1 方程 y = A1*exp(-x/t1) + y0 绘图 A y0 0.1203 ± 0.00903 A1 1.03982 ± 0.01726 t1 1233.04048 ± 45.69878 Reduced Chi-Sqr 6.16924E-5 R平方(COD) 0.99895 调整后R平方 0.99866
以此为例，因不同样品碱性蛋白酶酶活力不同，函数关系或有差别，但变化趋势一致，根据该函数意义，调整A1 ,当样品变化时，将单次已测稀释倍数下酶活力带入该方程，求出系数A1，以该函数为模板，带入OD即Y值范围模拟求出稀释倍数N大致范围，最终稀释倍数取中间值，并根据所测酶活进行系数修正，验证函数准确性。
对于碱性蛋白酶酶活力测定小结，根据自身需要选择合适的测定手段，并以自身为基础进行选择。
1. 碱性蛋白酶酶活力测定根据需求选择，稳定性样品（干粉等）且少量样品（样品数量少
于4），通过预先估计酶活力范围选取合适稀释倍数，若酶活力确定较为模糊，根据经验选取较大稀释倍数稀释，稀释时根据函数关系，尽可能使更多的稀释点落入合适的OD范围内，因此稀释倍数选取不应等倍数稀释，应为指数倍数稀释。如稀释倍数1-10000，若选取5点稀释，应选取1、10、100、1000、10000而不是1、2500、5000、7500、10000。
碱性蛋白酶酶活力测定方法0.10.2稀释倍数N3.82727.654427.654415.3088311.481622.9632415.308830.6176622.963245.9264934.444868.88961349.753699.50721972.7168145.433628107.1616214.323242160.7424321.484863241.1136482.227294359.7568719.5136141539.63521079.27211807.53921615.0783161209.3952418.794741814.0933628.1867112721.1395442.27810674083.6228167.24516026131.17412262.3524059204.41618408.83361113820.0227640.04542220751.0841502.16814131157.2462314.471222446783.6993567.391835670252.08140504.227564105492.9210985.941391158411.6316823.362154237875.8475751.693333357204.1714408.1140153536393.610727870.2611020304060901301902804206309401410211031604740711010670160202405036110542208141012224018356027564041391062154093333014015300.311.481622.963234.444845.926468.8896103.3344149.2608218.1504321.4848482.2272723.34081079.271618.9062422.6183628.1865442.2788163.41812250.8718393.5227613.2541460.0662253.2493471.71140351.1210756.2316478.8475234.9713627.4107161216091810.326512.4958124.9916237.4874249.9832374.97485112.4623162.4455237.4204349.8826524.8239787.23591174.6061761.9092636.6153948.6755923.0138884.51913333.0320018.2830052.4245122.3667752.27101728.4152748.8229373.1344434.5517214776664.5116627117513250.392153045609013519528542063094514102115316547407110106651600524030360755416581330122115183360275340413460620865932310139999521022950.415.308830.617645.926461.235291.8528137.7792199.0144290.8672428.6464642.9696964.45441439.0272158.5413230.1574837.5817256.37110884.5616334.4924524.736817.6655280.0883004.31124628.9187134.8281008.3421971.8633646.5951503.2142881621455740.519.13638.27257.40876.544114.816172.224248.768363.584535.808803.7121205.5681798.7842698.1764037.6966046.9769070.46413605.720418.1130655.8746022.0869100.1103755.4155786.2233918.5351260.4527464.7792058.21189379178602026819680.622.963245.926468.889691.8528137.7792206.6688298.5216436.3008642.9696964.45441446.6822158.5413237.8114845.2357256.37110884.5616326.8424501.7336787.0555226.582920.12124506.5186943.4280702.2421512.5632957.6950469.81427255214322432183610.726.790453.580880.3712107.1616160.7424241.1136348.2752509.0176750.13121125.1971687.7952518.2983777.4465652.7748465.76612698.6519047.9728585.3642918.2264430.9196740.13145257.5218100.6327485.8491764.6738450.611088811665131250042837547550.8A 680nm30.6176x（U/ml）61.235291.8528122.4704183.7056275.5584398.0288581.7344857.29281285.9391928.9092878.0544317.0826460.3149675.16214512.7421769.1132668.9849049.473635.33110560.2166008.6249257.9374269.5562016.7843943.51267293190300628576324291148E-N0.039236稀释倍数ˆN1.50165313.0033061～44.5049595～76.00661210～159.00991815～2013.5148820～5019.5214950～10028.53141100～20042.04628200～30063.06943300～40094.60414400～500141.1554500～600211.7331600～700316.8488700～800474.5224800～900711.7835900～10001067.6751000～15001602.2641500～20002405.6482000～25003611.4762500～30005422.4693000～35008141.9633500～400012224.964000～450018356.214500～500027564.345000～550041391.565500～600062154.926000～700093333.747000～8000140153.88000～9000210461.29000～10000酶活力范围（U/ml）稀释倍数ˆN10～1510000～1200010～6012000～1400050～10514000～16000100～22516000～18000150～30018000～20000200～75020000～22000500～150022000～240001000～300024000～260002000～450026000～280003000～600028000～300004000～750030000～320005000～900032000～340006000～1050034000～360007000～1200036000～380008000～1350038000～400009000～1500040000～4500010000～2250045000～5000015000～3000050000～5500020000～3750055000～6000025000～4500060000～6500030000～5250065000～7000035000～6000040000～6750045000～7500050000～8250055000～9000060000～10500070000～12000080000～13500090000～150000酶活力范围（U/ml）100000～180000120000～210000140000～240000160000～270000180000～300000200000～330000220000～360000240000～390000260000～420000280000～450000300000～480000320000～510000340000～540000360000～570000380000～600000400000～675000450000～750000500000～825000550000～900000600000～975000650000～105000 碱性蛋白酶酶活力测定方法0.10.20.2610.3酶活力X3.82727.65441011.4816153.9193141.9596571.51.306438307.8386293.91931432.6128766015.677267.83862965.22575310527.435213.717610.59.14506716543.1124621.5562316.514.3708225566.6283433.3141725.522.20945390101.902250.951093933.96739600156.772678.386296052.25753915239.0782119.539191.579.692731380360.5769180.2885138120.19232085544.7847272.3923208.5181.59493135819.1367409.5684313.5273.045647101230.665615.3324471410.221670801849.916924.9582708616.6388106352778.7941389.3971063.5926.2646159604170.1512085.07515961390.05239556259.1453129.5732395.52086.382359409390.6774695.33935943130.2265392514089.947044.9685392.54696.6458089521136.8610568.438089.57045.62112135031707.2515853.631213510569.0818204047564.823782.41820415854.9327307571351.1235675.5627307.523783.71409620107028.653514.324096235676.21614445160546.980273.4461444.553515.63921675240822.3120411.192167.580274.091382505361231.4180615.7138250.5120410.52073765541849.1270924.6207376.5180616.40.326512.495811.2004032.4008054.801618.40281813.2044320.4068431.2104748.016173.22456110.437166.856250.8841376.9264566.59851.08541277.2281917.0432876.1654315.4476473.7719711.25714568.0921853.3332780.5949172.0973758.74110637.5165956.90.3921512471117264061921392093144727091064159723963595539380901213618205273084096361445921671382510.415.30880.9798291.9596573.9193146.858810.7781116.6570925.4755439.1931459.7695490.14423136.1962204.7842307.6662462.4791694.69851042.5381564.7862347.6693522.4845284.2167926.81311891.217837.7826757.1640136.7260205.5790307.86135462.30.519.1360.7838631.5677263.1354525.487048.62249213.3256720.3804331.3545247.8156472.11538108.9569163.8273246.1329369.9833555.7588834.03011251.8291878.1352817.9874227.3726341.4519512.9614270.2221405.7332109.3848164.4572246.29108369.80.622.96320.6532191.3064382.6128764.5725337.1854111.1047216.983726.1287639.8463660.0961590.79745136.5228205.1108308.3194463.1323695.02511043.1911565.1132348.3233522.815284.5427927.46711891.8517838.1126757.8140137.0560205.2490308.190.726.79040.5599021.1198042.2396083.9193146.1589239.51833514.5574522.3960834.1540351.5109977.82639117.0195175.8092264.2738396.9706595.7358894.16361341.5252012.8483019.5524529.6086794.97110193.0215289.8122935.2734403.1851604.4977407.020.8A 680nm30.6176x（U/ml）0.4899140.9798291.9596573.42945.3890578.32854312.7377719.5965729.8847745.0721268.09809102.3921153.8331231.2395347.3492521.2688782.39311173.8351761.2422642.1083963.4075945.68918.8913378.5820068.3630102.7845153.9367731.14酶活力范围（U/ml）推荐稀释倍数ˆN1～10-10～15115～501～550～1004～10100～1507～15150～30010～30300～40020～40400～50027～50500～60034～60600～70040～70700～80047～80800～90054～90900～100060～1001000～150067～1501500～2000100～2002000～2500134～2502500～3000167～3003000～3500200～3503500～4000234～4004000～4500267～4504500～5000300～5005000～6000334～6006000～7000400～7007000～8000467～8008000～9000534～9009000～10000600～100010000～20000667～200020000～300001334～300030000～400002000～4000酶活力范围（U/ml）40000～5000050000～7000070000～100000100000～150000150000～200000200000～250000250000～300000300000～350000350000～400000400000～450000450000～500000500000～600000600000～700000700000～800000800000～900000900000～10000001000000～1500000推荐稀释倍数ˆN2667～50003334～70004667～100006667～1500010000～2000013334～2500016667～3000020000～3500023334～4000026667～4500030000～5000033334～6000040000～7000046667～8000053334～9000060000～10000066667～150000 2.对于大量样品酶活力测定，可以先不做对照，预先估计所有样品酶活力总的大致范围，选取合适的稀释倍数，此时可以不做平行，酶活力测定时只需一空白一对照，最后得到大致OD范围，然后带入单指数函数求出常数A1，得到方程式，然后将合适的OD值范围带入方程求出大致稀释倍数。（方程式可以通过软件直接得出所求值），对于同批次样品，稀释倍数相近的应就近归为一类，选择相同稀释倍数。 酶活力测定注意事项
1. 严格按照国标测定方法进行，酪蛋白应充分煮沸溶解，显色时间应严格控制，当样品数
量较少时可以直接反应测定，当样品较多时，大于5个时应保证每一组平行样的反应时间都为10分钟，此时可选取定时加样，等间隔时间段加入样品，即如果样品较多，可以每隔15秒加一排样品，最后无论如何都保证了每组样都反应了10分钟，因为样品多的时候从第一个开始加到最后一个加完需要的时间可达到2分钟之久，当加入三氯乙酸终止反应时候最终也需要两三分钟，如果加太快可能会导致移液枪空吸倒吸，液体沾壁，导致加入的液体量不够，所以不论加入或者终止反应应该匀速，而开始反应先加入的酪蛋白1ml，最后反应加入的是2ml的三氯乙酸，建议最好不要用5ml的移液枪加入2ml液体，我多次加入多次校准移液枪时发现，5ml移液枪加入的液体误差可达50-120ul，当加入更快时候会发现沾壁更加严重，吸入的液体未能全部加入到试管中，因此缓慢的加入，使得液体沿移液枪的枪头内壁缓缓流下是最好的选择，因加入时间太长，因此需要计时加入，保证每排样品加入的时间都完全一致，根据我的手速，我发现每隔15秒加入一排样品正好，也不会太急，正好加入3个对照样差不多就15秒了，然后继续加入下一个，加入时的顺序应该是先加入酶液1ml，酪蛋白溶液预热5min，之后一个空白三个平行，平行样此时加入酪蛋白开始计时，加完之后加空白样中的三氯乙酸，等10分钟后平行样开始加入三氯乙酸，空白样最后加入酪蛋白。
2. 预热阶段要充分，应等样品温度与反应温度一致时开始反应，显色阶段福林酚碳酸钠等
加入顺序要正确，应该先加入碳酸钠然后加入离心完的上清最后加入福林酚，顺序不可搞混，不然会导致溶液不显色。且加入完毕后应立即混匀显色，显色吸光与反应时间有关，反应时间在0-15min增加明显，在15min之后吸光增加开始变缓，但这并不意味着显色时间过了15minOD就不再变化，此时OD也在增加，显色完毕后若不立即测定光吸收，在室温环境下（特别是炎热的夏天），耽搁较长时间会使得结果大大偏高，影响测定结果准确性。
3. 测定的OD应该在0.261-0.392（这是根据国标推荐的稀释液的酶活力在10-15U/ml换
算出来的），先前讲过OD在0.2-0.4时候酶活力变化缓慢了，而当OD小于0.1时候会突然发现酶活力误差急剧增大，OD 稀释倍数 酶活力再无显著关系，此时数值非常不可靠，这可能由于分光光度计的检测机理和机器有关。
以下是角蛋白酶活力测定过程中遇到的现象，与碱性蛋白酶类似，随着稀释倍数增大，角蛋白酶活力显著增加，与碱性蛋白酶的酶活力-OD或者N的关系，在OD0.2-0.4直接并无缓慢表现，这只能严格控制角蛋白酶活力测定过程中的OD值。 角蛋白酶活力测定时稀释不同倍数，
800000.44 A X
N 6000030.3
400002
0.2
200001
0.1
0200040006000020004000 NN480000 X X
360000
240000 120000
0.10.20.30.40.10.20.3
AA
至于胶原酶活力测定过程中可能会出现加入茚三酮显色完加入乙醇溶液会导致蓝色逐渐消失，此时可能因为乙醇溶液空气中暴露时间过长，导致溶解较多氧气，会导致氧化其中的有色物质，因此60%乙醇溶液长时间保存使用时候可以提前超声去除多余氧气，对于有些样品产生棕红色沉淀可能因为稀释倍数太小，加大稀释倍数可以解决问题，在茚三酮显色过程中影响最大的因素就是pH值，若出现问题可以用pH计检测溶液pH即可检测出出现的问题，弹性蛋白酶活力、胶原酶活力还在测定中，出现的问题还在继续解决
1.对于一个已经测定OD680的碱性蛋白酶活力，OD值在0.261-0.392范围之外，但又在0.1-0.8之间，确定下次稀释倍数可以采取下列步骤
2.如果测定的碱性蛋白酶的稀释倍数为N1 OD680为 A1，将A1带入Oringin中的由X查找Y（拟合选项-查找X-Y/Y-X），输入A1，自动计算出N2
AXX6000XX0.43.对于碱性蛋白酶的酶活力测定过程中，自动默认相等酶活具有等效性，在此基础上才可以将其余的碱性蛋白酶活力的X-A-N等关系带入模拟的函数中，只有承认该基础才可以进一步计算
4.故下一次选取范围为N1/N2（1654.856～2466.264）,最佳的稀释倍数为最佳稀释倍数为N1/N2（1995） (在该函数关系下N=2466 A=0.261,N=1655 A=0.392,N=1995 A=0.3265 A为0.261-0.392的中值)
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