1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。
微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法
计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN法）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。
供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验
供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
表1 试验菌液的制备和使用
计数培养基适用性检查
试验菌株
试验菌液的制备
需氧菌总数计数 胰酪大豆胨
胰酪大豆胨琼脂培养基琼脂培养基和胰酪大豆
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
或胰酪大豆胨液体培养胨液体培养基，培养温
霉菌和酵母菌总数计数
计数方法适用性试验 需氧菌总数计数 胰酪大豆胨琼脂培养基/ 胰酪大豆胨液体培养基 （MPN法），培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu 胰酪大豆胨琼脂培养基/ 胰酪大豆胨液体培养基 （MPN法），
霉菌和酵母菌总数计数
基，培养温度30～
aureus) 度30～35℃，培养
〔CMCC(B)26 003)〕
35℃，培养时间不超过
接种量时间18～243天，小时
不
大
于
100cfu 胰酪大豆胨
胰酪大豆胨琼脂培养基琼脂培养基和胰酪大豆
铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa） 〔CMCC（B）10 104〕
或胰酪大豆胨液体培养胨液体培养基，培养温基，培养温度度
30～
培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu 胰酪大豆胨
30～35℃，培养
35℃，培养时间不超过接种量时间18～243天，小时
不
大
于
100cfu
枯草芽孢杆菌 胰酪大豆胨胰酪大豆胨 (Bacillus
琼脂培养基琼脂培养基
琼脂培养基/ 胰酪大豆胨
subtilis) 或胰酪大豆和胰酪大豆
〔CMCC(B) 63 501〕 胨液体培养胨液体培养
基，培养温基，培养温度
30～度
30～
液体培养基 （MPN法），培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu
35℃，培养35℃，培养时间18～24时间不超过小时
3天，接种量不
大
于
100cfu
沙氏葡萄糖胰酪大豆胨沙氏葡萄胰酪大豆胨沙氏葡萄琼脂培养基琼脂培养糖琼脂培琼脂培养基糖琼脂培
白色念珠菌 (Candida albicans) 〔CMCC(F) 98 001〕
或沙氏葡萄基，培养温养基，培养（MPN法不适养基，培养糖液体培养度
30～温度 20～用），培养温温度 20～
基，培养温35℃，培养25℃，培养度30～35℃，25℃，培养度
20～时间不超过时间不超培养时间不时间不超
25℃，培养5天，接种量过5天，接超过5天，接过5天，接时间2～3不天 沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡
胰酪大豆胨沙氏葡萄胰酪大豆胨琼脂培养糖琼脂培琼脂培养基
沙氏葡萄糖琼脂培
大
于种量不大种量不大于种量不大
于100cfu 100cfu
于100cfu
100cfu
黑曲霉 (Aspergillus
niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间5～7天，或直到获得丰富的孢子
基，培养温养基，培养（MPN法不适养基，培养度
30～温度 20～用），培养温
温度 20～
35℃，培养25℃，培养度30～35℃，25℃，培养时间不超过时间不超培养时间不
时间不超
5天，接种量过5天，接超过5天，接过5天，接不
大
于种量不大种量不大于
于100cfu
100cfu
种量不大于100cfu
100cfu
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
菌种及菌液制备
菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
菌液制备 按表1规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
阴性对照
为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验， 阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
培养基适用性检查
微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1规定条件下培养。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
计数方法适用性试验 ⒈供试液制备
根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。
常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。
⑴ 水溶性供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
⑵ 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
⑶ 油脂类供试品 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40℃（特殊情况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成1∶10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。
⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
膜剂供试品 取供试品,剪碎,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制成1∶10的供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品，加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂），置45℃水浴中,振
摇,使溶解,制成1∶10的供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
气雾剂、喷雾剂供试品 取供试品,置-20℃或其它适宜温度冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出，供试品亦可采用其它适宜的方法取出。用无菌注射器从每一容器中吸出全部药液于无菌容器中混合，然后取样检查。
贴膏剂供试品 取供试品,去掉防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上，在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨脂80或卵磷脂）稀释液的容器中，振荡至少30分钟。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
⒉ 接种和稀释
按下列要求进行供试液的接种和稀释,制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。
（1） 试验组 取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。
（2） 供试品对照组 取制备好的供试液, 以稀释液代替菌液同试验组操作。
（3）菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适应性试验。
⒊ 抗菌活性的去除或灭活
供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%，可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。 ⑴ 增加稀释液或培养基体积。
⑵ 加入适宜的中和剂或灭活剂。
中和剂或灭活剂（表2）可用于消除抗菌剂的抑菌活性， 最好在稀释剂或培养基灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5～2范围内。
表2 常见干扰物的中和剂或灭活方法
干扰物 戊二醛、汞制剂
酚类、乙醇、醛类、吸附物 醛类
季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍类化合物
季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸 水银
水银、汞化物、醛类 EDTA、喹喏酮类抗生素 磺胺类
β-内酰胺类抗生素 ⑶ 采用薄膜过滤法。 ⑷ 上述几种方法的联合使用。
若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有抗菌活性，同时也表明供试品不可能被该类微生物污染。但是，供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检查。
⒋ 供试品中微生物的回收
聚山梨醇酯 巯基醋酸盐 硫代硫酸盐 镁或钙离子 对氨基苯甲酸 β-内酰胺酶
可选用的中和剂或灭活方法 亚硫酸氢钠 稀释法 甘氨酸 卵磷脂
表1所列的计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法。
⑴ 平皿法 平皿法包括倾注法和涂布法。表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。
倾注法 取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或灭活”制备的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中, 注入15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。
涂布法 取15～20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增加。每一平板表面接种上述照“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或灭活”制备的供试液不少于0.1ml。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。
⑵ 薄膜过滤法 薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45μm,直径一般为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。
取照上述 “供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或灭活”制备
2
的供试液适量（一般取相当于1g、1ml或10cm的供试品, 若供试品中所含的菌
数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中,混匀,过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。
若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。
按表1规定条件培养、计数。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
⑶ MPN法 MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。若使用MPN法，按下列步骤进行。
取照上述 “供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或灭活”制备的供试液至少3个连续稀释级，每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有9～10ml胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。
接种管置30～35℃培养3天，逐日观察各管微生物生长情况。如果由于供试品的原因使得结果难以判断，可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相同条件下培养1～2天，观察是否有微生物生长。根据微生物生长的管数从表3查对被测供试品每1g或每1ml中需氧菌总数的最可能数。
表3微生物最可能数检索表
生长管数
每管含样品的g或ml数 0.1 0.01 0.001 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 1 0 1 1 1 1 2 0 1 2 1 1 3 0 2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 1 0
需氧菌总数最可能数
MPN/g或ml
＜3 3 3 6.1 6.2 9.4 3.6 7.2 11 7.4 11 11 15 16 9.2 14 20 15
95%置信限 下限 上限 0 9.4 0.1 9.5 0.1 10 1.2 17 1.2 17 3.5 35 0.2 17 1.2 17 4 35 1.3 20 4 35 4 35 5 38 5 38 1.5 35 4 35 5 38 4 38
2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 1 2 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 20 27 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 ＞1100 5 38 9 94 5 40 9 94 9 94 9 94 9 94 5 94 9 104 16 181 9 181 17 199 30 360 30 380 18 360 30 380 30 400 90 990 40 990 90 1980 200 4000
注：表内所列检验量如改用1g（或ml）、0.1g（或ml）和0.01g（或ml）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 g（或ml）、0.001 g（或ml）和0.0001 g（或ml）时，表内数字应相应增加10倍，其余类推。
⒌ 结果判断
计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法或时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内；采用MPN法，试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内。若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
方法适用性确认时,若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求,那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。
供试品检查
检验量
检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。
一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。
除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药
品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4丸,膜剂还不得少于4片。供试品的检查
按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。
阴性对照试验 以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
⒈ 平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法。除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平皿。
培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3～5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5～7天， 观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15，则两个平皿的菌落数不能相差1倍或以上。
菌数报告规则 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml或10cm2供试品中所含的微生物数。
如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
⒉ 薄膜过滤法
除另有规定外，按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备。取相当
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于1g、1ml或10cm供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀
释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培
养基上培养。
培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
菌数报告规则 以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品）,或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
⒊ MPN法
取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和供试品接种，所有试验管在30～35℃培养3～5天，如果需要确认是否有微生物生长，按方法适应性试验确定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长的管数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数的最可能数。
结果判断
需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查。若采用MPN法，测定结果为需氧菌总数。
各品种项下规定的微生物限度标准解释如下： 101cfu： 可接受的最大菌数为20； 10cfu： 可接受的最大菌数为200；
103cfu： 可接受的最大菌数为2000：依此类推。
若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。
稀释液、冲洗液及培养基
见非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）
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