(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105136941 A (43)申请公布日 2015.12.09
(21)申请号 201510696097.9(22)申请日 2015.10.22
(71)申请人汤臣倍健股份有限公司
地址519090 广东省珠海市金湾区三灶科技
工业园星汉路19号(72)发明人蔡伟江 魏鲜娥 陈彩云(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人赵青朵(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01)
权利要求书1页 说明书7页 附图1页
(54)发明名称
一种β-胡萝卜素的检测方法(57)摘要
本发明涉及分析领域，尤其涉及一种β-胡萝卜素的检测方法。本发明采用碳酸钠溶液调节pH条件，采用甲醇和乙腈的混合液作为提取液，并采用超声提取的方式对待测物进行提取从而缩短了前处理的时间，提高了前处理过程对β-胡萝卜素的提取效率，进而提高了检测的精密度和准确度，降低了检测限。实验表明，本发明提供的方法对β-胡萝卜素检测的最低检测浓度为0.00398μg/mL；定量浓度为0.013μg/mL。重复检测6份样品含量的RSD为0.7％，精密度良好；加标回收率为99.4％，准确度良好。
C N 1 0 5 1 3 6 9 4 1 A CN 105136941 A
权 利 要 求 书
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1.一种β-胡萝卜素的检测方法，其特征在于，包括：将待测品以碳酸钠溶液溶解，经甲醇和乙腈的混合液提取后，以高效液相色谱检测，采用外标法对β-胡萝卜素定量；
所述提取为超声提取，超声提取时间为10min～20min。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测品为保健品；所述保健品的剂型为胶囊剂或片剂。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述碳酸钠溶液中碳酸钠的浓度为0.05mol/L～2mol/L。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲醇和乙腈的混合液中甲醇与乙腈的体积比为(7～9):(1～3)。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲醇和乙腈的混合液与碳酸钠溶液的体积比为9:1。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超声提取的温度为30℃～40℃；功率为500W；频率为50kHz。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取后与高效液相色谱检测之间还包括：冷却、定容、过滤的步骤。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的色谱柱为Inertsil C18；所述色谱柱的尺寸为4.0mm*75mm,3μm。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的流动相为甲醇和乙腈的混合液，其中甲醇和乙腈的体积比为9:1。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的洗脱程序为等度洗脱，运行时间为15min。
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说 明 书
一种β-胡萝卜素的检测方法
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技术领域
[0001]
本发明涉及分析领域，尤其涉及一种β-胡萝卜素的检测方法。
背景技术
β-胡萝卜素(beta-Carotene)，分子式为C40H56，是人体重要的营养素，是保健食品的重要成分。目前市场上存在许多含有β-胡萝卜素的保健品，例如：螺旋藻、多种维生素等。但目前市场上各种保健品的质量良莠不齐，所以寻求一种可靠的功效成分的检测方法成为保健品质量监管的需要。[0003] 目前，我国测定β－胡萝卜素的方法有纸层析法、薄层层析法、柱层析法、分光光度法、高效液相色谱法或液质联用法等，其中国标GB/T5009.83-2003中提供的方法是目前检测食品中胡萝卜素含量最常用的方法。但是该方法前处理时间长，检出限高，当检测保健品中的β-胡萝卜素时，常常无法检出含量，已经不能满足目前对保健食品中β-胡萝卜素定量检测的要求。此外，国标检验时间长、前处理复杂、使用毒性大的溶剂溶解样品容易危害检测人员健康。
[0004] 保健品中常用的辅料为填充剂、崩解剂、增稠剂、乳化剂等，保健品中常见的活性成分除β-胡萝卜素外，还包括各种微量元素、维生素、氨基酸等。因此，保健品中的辅料和活性成分都对β-胡萝卜素的检测造成了不利影响，为了能够提高检测的灵敏度，现有技术中常采用强极性的溶剂对待测物进行萃取或作为流动相，然而实验表明，一味的提高溶剂的极性其实并不利于检测限的降低。[0005] 因此，开发一种新的适用于保健品的β-胡萝卜素的方法十分必要。
[0002]
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种β-胡萝卜素的检测方法，本发明提供的方法检测所需时间短，灵敏度，准确度、精密度皆良好。[0007] 本发明提供的β-胡萝卜素的检测方法包括：将待测品以碳酸钠溶液溶解，经甲醇和乙腈的混合液提取后，以高效液相色谱检测，采用外标法对β-胡萝卜素定量；[0008] 提取为超声提取，超声提取时间为10min～20min。[0009] 在本发明的实施例中，待测品为保健品；保健品的剂型为胶囊剂或片剂。[0010] 在一些实施例中，保健品为螺旋藻片、螺旋藻胶囊、复合维生素片、复合维生素胶囊。
[0011] 在一些实施例中，保健品为汤臣倍健多种维生素片(女士)。
[0012] 本发明提供的检测方法能够用于对保健品中β-胡萝卜素的定量，待测品为胶囊剂则取内容物检测，待测品为片剂则将片剂研碎检测。
[0006]
利用高效液相色谱(HPLC)对物质进行定量检测是目前常用的检测方法，在面对需要对保健食品中的β-胡萝卜素进行定量分析时，采用高效液相色谱是一种快速有效的方式。影响高效液相色谱检测准确度、灵敏度和精密度的因素除高效液相色谱的条件外，前
[0013]
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说 明 书
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处理的步骤亦十分重要。本发明采用碳酸钠溶液调节pH条件，采用甲醇和乙腈的混合液作为提取液，并采用超声提取的方式对待测物进行提取从而缩短了前处理的时间，提高了前处理过程对β-胡萝卜素的提取效率，进而提高了检测的精密度和准确度，降低了检测限。[0014] 精密度：对6份样品平行进样进行定量检测，所得β-胡萝卜素含量的RSD(％)为：0.7％，其RSD(％)小于3.8％，表明该方法有较好的精密度,符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求RSD(％)≥3.8％】。[0015] 灵敏度：分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比(S/N)计算。以本发明提供的方法进行检测，最低检测浓度为0.00398μg/mL，定量浓度为0.013μg/mL。[0016] 准确性：本发明提供方法的加标回收率为99.4％，相对标准偏差(RSD)分别为1.0％,符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求回收率为95％～105％】。[0017] 线性评价：相关系数R2为0.9995,所以用该方法测定β-胡萝卜素的含量，在浓度为0.199μg/mL至2.981μg/mL之间呈现良好的线性,符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求相关系数R2≥0.99】。[0018] 实验表明，本发明提供的方法对β-胡萝卜素检测的最低检测浓度为0.00398μg/mL；定量浓度为0.013μg/mL。重复检测6份样品含量的RSD为0.7％，精密度良好；加标回收率为99.4％，准确度良好。
[0019] 本发明采用碳酸钠调节提取液为碱性，从而提高β-胡萝卜素的提取效果。[0020] 在本发明的实施例中，碳酸钠溶液中碳酸钠的浓度为0.05mol/L～2mol/L。[0021] 在一些实施例中，碳酸钠溶液中碳酸钠的浓度为0.1mol/L。[0022] 在本发明的实施例中，甲醇和乙腈的混合液中甲醇与乙腈的体积比为(7～9):(1～3)。
[0023] 在一些实施例中，甲醇和乙腈的混合液中甲醇与乙腈的体积比为7:3。[0024] 在本发明的实施例中，甲醇和乙腈的混合液与碳酸钠溶液的体积比为9:1。[0025] 在本发明的实施例中，超声提取的温度为30℃～40℃；功率为500W；频率为50kHz。
[0026] 在一些实施例中，超声提取的温度为35℃[0027] 在本发明的实施例中，待测品与碳酸钠溶液的质量-体积比为0.2g：5mL。[0028] 在本发明的实施例中，待测品与甲醇和乙腈的混合液的质量-体积比为0.2g：45mL。
[0029] 在本发明的实施例中，超声提取的时间为15min。[0030] 在本发明的实施例中，提取后与高翔液相色谱检测之间还包括：冷却、定容、过滤的步骤。
[0031] 在一些实施例中，冷却至室温。[0032] 在一些实施例中，定容具体为，在超声过程中，如有溶剂挥发则以甲醇和乙腈的混合液定容至待测品与溶液的质量-体积比为0.2g：50mL。在一些实施例中，过滤采用0.45μm滤膜。[0034] 对本发明提供的方法而言，根据β-胡萝卜素的极性选择C18色谱柱。色谱柱的尺寸会对分离结果产生影响，其内径会对流动相的流速产生影响，长度较短的色谱柱运行
[0033]
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时间短，柱压较低；长度较长的色谱柱分辨率稿，但运行时间增长。[0035] 在本发明的实施例中，高效液相色谱检测的色谱柱为Inertsil C18；所述色谱柱的尺寸为4.0mm*75mm,3μm。
[0036] 对柱温的选择需考虑待分离物质本身的特性，柱温影响流动相对待测物质的溶解度也会影响柱压。一般情况下，提高柱温有利于提高分离度，但温度过高会导致柱压过低，不利于物质的检出。
[0037] 在一些实施例中，高效液相色谱的柱温为40℃。
[0038] 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相对样品具有一定的溶解能力且与样品不产生化学反应，其黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；且流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用紫外检测器，则应使用对紫外吸收较低的溶剂配制。其沸点不可以太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。对于β-胡萝卜素而言，以本发明提供的流动相进行等度洗脱能够保证更好的检测效果，优于其他流动相的检测结果。[0039] 在本发明的实施例中，高效液相色谱检测的流动相为甲醇和乙腈的混合液，其中甲醇和乙腈的体积比为9:1。[0040] 在本发明的实施例中，流动相的流速为1.0mL/min。[0041] 在本发明的实施例中，高效液相色谱检测的洗脱程序为等度洗脱，运行时间为15min。
[0042] 在本发明的实施例中，高效液相色谱的进样量为10μL。[0043] 在本发明的实施例中，前处理后，进入高效液相色谱的时间为6h以内。[0044] 在本发明的实施例中，高效液相色谱的检测器为紫外检测器，检测波长为448nm。[0045] 在本发明的实施例中，高效液相色谱以保留时间定性。[0046] 在本发明提供的方法中，β-胡萝卜素的保留时间为12.2min±0.1min。[0047] 在本发明的实施例中，外标法对β-胡萝卜素的定量方法具体为：根据β-胡萝卜素标准品浓度与高效液相色谱检测所得峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得β-胡萝卜素的含量。
[0048] 在一些实施例中，β-胡萝卜素的标准曲线的绘制方法为，以β-胡萝卜素的浓度为横坐标，以HPLC检测色谱中β-胡萝卜素的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
[0049] 以本发明提供的方法获得的β-胡萝卜素含量的线性方程为：Y＝147.23x+0.8348，R2＝0.9995。
[0050] 用该方法测定β-胡萝卜素的含量，在浓度为0.199μg/mL至2.981μg/mL之间呈现良好的线性。
[0051] 本发明提供的检测方法能够用于对保健品中β-胡萝卜素的定量，本发明采用碳酸钠溶液调节pH条件，采用甲醇和乙腈的混合液作为提取液，并采用超声提取的方式对待测物进行提取从而缩短了前处理的时间，提高了前处理过程对β-胡萝卜素的提取效率，进而提高了检测的精密度和准确度，降低了检测限。实验表明，本发明提供的方法对β-胡萝卜素检测的最低检测浓度为0.00398μg/mL；定量浓度为0.013μg/mL。重复检测6份样品含量的RSD为0.7％，精密度良好；加标回收率为99.4％，准确度良好。
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附图说明
图1示β-胡萝卜素对照品的检测结果；[0053] 图2示β-胡萝卜素的标准曲线。
[0052]
具体实施方式
[0054] 本发明提供了一种β-胡萝卜素的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0055] 本发明采用的试剂、药品或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中：甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；石油醚(分析纯，沸程30℃～60℃)；三氯甲烷(分析纯)；β-胡萝卜素对照品(来源：Dr；批号：20402；含量：96.3％)。高效液相色谱仪为安捷伦1260型高效液相色谱仪；超声采用KQ-500E型超声仪。[0056] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：[0057] 实施例1
[0058] 对照品贮备液的配制：精确称取β-胡萝卜素对照品10.32mg于100mL容量瓶中，用约50mL三氯甲烷溶解后，再用石油醚(沸程30℃～60℃)定容至刻度，超声2分钟，使β-胡萝卜完全溶解，放冷至室温，摇匀，放在-18℃的冰箱中储存备用。[0059] 对照品溶液的制备：精密吸取β-胡萝卜素贮备溶液5.00mL于50mL容量瓶中，加入甲醇：乙腈＝(7:3)混合液至刻度，摇匀，即得β-胡萝卜素对照溶液。[0060] 分别精密吸取β-胡萝卜素对照品溶液1mL、2mL、5mL、10mL、15mL于50mL容量瓶中，加甲醇：乙腈＝(7:3)混合液至刻度，摇匀，即得β-胡萝卜素标准使用液，分别得到浓度为0.199μg/mL、0.398μg/mL、0.994μg/mL、1.988μg/mL、2.981μg/mL的工作标准溶液,经0.45μm的微孔滤膜过滤，进样量为10μL,[0061] 液相色谱条件：[0062] 色谱柱：Inertsil C18,4.0mm*75mm,3μm[0063] 流动相：甲醇:乙腈＝90:10[0064] 流速：1.0mL/min[0065] 柱温：40℃[0066] 进样量：10μL[0067] 检测器：紫外检测器448nm[0068] 运行时间：15min
[0069] 对β-胡萝卜素对照品检测的色谱图如图1。以各使用液的浓度X(μg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准工作曲线。检测结果如表1，标准曲线如图2.[0070] 表1 对使用液的检测结果
[0071]
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相关系数R2为0.9995,所以用该方法测定β-胡萝卜素的含量，在浓度为0.199μg/mL至2.981μg/mL之间呈现良好的线性,符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求相关系数R2≥0.99】。[0073] 实施例2
[0074] 分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比(S/N)计算。DL定义为S/N＝3时对应的待分析物浓度，QL定义为S/N＝10时对应的待分析物浓度。[0075] 检出限
[0076] 精密量取浓度为0.994μg/mL的β-胡萝卜素工作标准溶液1mL至250mL容量瓶中,加甲醇：乙腈＝(7:3)混合液至定容，即得浓度为0.00398μg/mL的标准品溶液。[0077] 取信噪比为(3：1)定方法的检测浓度为：DL(β-胡萝卜素)＝0.00398μg/mL，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.00398μg/mL×50mL/0.2g＝0.995μg/g。[0078] 定量限
[0079] 取信噪比为(10∶1)定方法的检测浓度为：QL(β-胡萝卜素)＝0.013μg/mL，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.013μg/mL×50mL/0.2g＝3.25μg/g。[0080] 实施例3
[0081] 取试样20粒(片)或10g(汤臣倍健多种维生素片(女士)20130801)，研细，混合均匀，称取试样约0.2g置于50ml棕色容量瓶中，加入0.1mol/L碳酸钠溶液5mL，超声溶解，再加入甲醇:乙腈＝(7：3)的混合液，35℃超声(功率500W，频率50kHz)处理至提取完全(约15min)，取出放置至室温，定容至刻度，摇匀，离心，经0.45μm的滤膜过滤，即得。作为供试品溶液，进样量为10μL。
[0072] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089]
液相色谱条件：
色谱柱：Inertsil C18，4.0mm*75mm，3μm；流动相：甲醇:乙腈＝90:10流速：1.0mL/min柱温：40℃进样量：10μL检测器：紫外检测器448nm运行时间：15min
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根据实施例1制得的标准曲线定量。
试样中的β-胡萝卜素按以下公式计算:X＝V×C/M式中：
X—样品中β-胡萝卜素含量，μg/g；C—样品溶液中β-胡萝卜素的质量浓度，μg/mL；M—样品的质量，g；V—样品稀释的总体积，mL。称取6份样品，检测样品含量，计算其RSD(％)。表2，6份样品β-胡萝卜素检测结果
6份样品含量的RSD(％)为：0.7％，其RSD(％)小于3.8％，表明该方法有较好
的精密度,符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求RSD(％)≥3.8％】。[0102] 实施例4
[0103] 加标样品的处理：精密称取0.2g研磨均匀的样品9份(样品为汤臣倍健多种维生素片(女士)20130801)，于50mL容量瓶中，分成3组，每组3份，于每一组中分别精密加入浓度为9.938μg/mLβ-胡萝卜素标准工作液1.6mL、2.0mL、2.4mL。加入0.1mol/L碳酸钠溶液5mL，超声溶解，再加入甲醇:乙腈＝(7：3)的混合液，35℃超声(功率500W，频率50kHz,)处理至提取完全(约15min),取出放置至室温，定容至刻度，摇匀，离心，经0.45μm的滤膜过滤，即得。作为加标溶液，取该加标溶液10μL进样。[0104] 液相色谱条件：[0105] 色谱柱：Inertsil C18，4.0mm*75mm，3μm；[0106] 流动相：甲醇:乙腈＝90:10[0107] 流速：1.0mL/min[0108] 柱温：40℃[0109] 进样量：10μL[0110] 检测器：紫外检测器448nm
[0101]
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运行时间：15min
[0112] 根据实施例1制得的标准曲线定量。[0113] 表3：回收率试验结果表
[0114]
测得对照品投入量＝加标样品测得量-样品测得量[0116] 回收率(％)＝测得对照品量/加标量
[0117] 汤臣倍健多种维生素片(女士)加标平均回收率为：99.4％，相对标准偏差(RSD)分别为1.0％,符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求回收率为95％～105％】。
[0118] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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