在单一提取系统中同时测定植物ASA_DHA和GSH_GSSG

李忠光,　杜朝昆,　龚　明

(云南师范大学生命科学学院,云南昆明650092)

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摘　要:　文章介绍了在一个单一提取系统——5%磺基水杨酸中同时提取并测定了抗氧化剂ASA/DHA和GSH/GSSG,通过DTNB—GR循环的动力学分析固定了GSH/GSSG测定的最佳时间参数;通过与原提取和测定方法的比较,此法对于测定抗氧化剂有很好的准确性、重复性和可比性,使抗氧化剂的提取和测定变得简便快速。

关　键　词:　单一提取系统;抗氧化剂;动力学分析

中图分类号:　Q949.4　　文献标识码:　A　　文章编号:　1007-9793(2003)03-0067-04

　　植物细胞在其生命活动过程中,由于叶绿体、线粒体和质膜上每时每刻发生的电子传递过程中的电子泄漏,而不可避免地总会产生大量的活性氧。活性氧会导致生物大分子及膜系统的过氧化反应而损伤细胞。但植物细胞具有由多种抗氧化剂分子及抗氧化酶所组成的抗氧化系统,从而将活性氧控制在细胞可忍耐的水平

[1-6]

TCA)等;GSH/GSSG(oxidizedglutathione)提取系统有高氯酸(perchloricacid,PCA)、偏磷酸(meta-phosphoricacid,MPA)、磺基水杨酸(sulphosalicylicacid,SSA)等;ASA/DHA和GSH/GSSG提取样液的中和方法有磷酸缓冲液、

三乙醇胺、碳酸钾等,显得纷繁复杂。而由于各抗氧化剂在清除活性氧时的协同作用,所以在研究中常需同时测定多种抗氧化剂,如果使用不同的抗氧化剂提取系统,将使抗氧化剂提取工作量加大而难以进行。本文对抗氧化剂的提取和测定系统作了修改和完善,用单一提取系统——5%磺基水杨酸来提取抗氧化剂,用同一中和方法——三乙醇胺来中和ASA/DHA和GSH/GSSG的提取样液,使抗氧化剂的提取和测定比以前更加快速简便,通过与原提取和测定结果比较,差异不显著。此提取和测定方法有很好的准确性、重复性和可比性。

。抗氧化剂

分子包括还原型抗坏血酸(reducedascobate,ASA),还原型谷胱甘肽(reducedglutathione,

—生育酚,A—GSH),维生素E(亦称A

tocopherol)等。通过各抗氧化剂的协同作用,可把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如

・-・

O2、H2O2、OH等直接或间接地清除,防止了活

[7]

性氧的级联放大作用,阻止和延缓了细胞膜系统的脂质过氧化作用及生物大分子如蛋白质和核酸的氧化损伤,保障了细胞内各种生命代谢活动的正常进行。因此,抗氧化剂在植物生命活动中起着举足轻重的作用。

但是,目前在国内外的研究文献中,不同的抗氧化剂有不同的提取和测定系统,如ASA/DHA(dehydroascobate)的提取系统有高氯酸(per-chloricacid,PCA)、偏磷酸(meta-phosphoricacid,MPA)、三氯乙酸(trichloroaceticacid,

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收稿日期:2002-09-03

1　材料和方法

1.1植物材料的培养和处理

玉米种子(大黄品种)用0.1%HgCl2消毒10min,用蒸馏水洗净后于26.5℃下吸涨12h,然后

　　0基金项目:国家自然科学基金[39860007]、云南省自然科学基金及教育部优秀高校青年教师教学科研奖励计划[98C002Z]资助

　　　作者简介:李忠光(1971-),男,云南省永德县人,实验师,主要研究方向植物抗逆生物学.　　　通讯作者:龚明(Email:gongming@public.km.yn.cn).・68・

云南师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　第23卷

转入垫有6层湿润滤纸的白磁盘中,26.5℃下黑暗萌发60h,选取长势一致的玉米幼苗转入150ml0.1mMH2O2溶液中或蒸馏水中(对照),处理4h后,加入3倍体积的蒸馏水漂洗根系,再转入垫有6层湿润滤纸的白磁盘中恢复6h,取中胚轴作下列抗氧化剂分析。1.2抗氧化剂的提取

在前人研究的基础上,我们对抗氧化剂的提取系统作了修改,得到下列单一提取系统——5%磺基水杨酸。取经过上述处理的黄化玉米幼苗中胚轴(长约0.5cm)0.5g,加入预冷的5%磺基水杨酸2.5ml和少许石英砂,充分冰预研磨,转入离心管中,于4℃下20000×g离心20min,将上清液分装,液氮冷冻后于-20℃保存或直接进行抗氧化剂分析。1.3抗氧化剂的测定

1.3.1ASA/DHA测定。按照Jiang的方法,并作如下修改:取100Ll上清液,加入24Ll1.84mol/L三乙醇胺以中和样液,加入250ml50mmol/L磷酸缓冲液,pH7.5,内含2.5mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸),加入50Ll10mmol/LDTT(二硫苏糖醇),25℃保温10min,使DHA还原为ASA,加入0.5%乙基马来酰亚胺50Ll,混匀,以除去剩余的DTT,此时分别加入10%TCA,44%磷酸,4%双吡啶(用70%乙醇配制)各200Ll,混匀,加入3%FeCl3100Ll,混匀,40℃水浴1h,到时在525nm处测出OD值。此法用来测定样品中总的抗坏血酸的量。在还原型抗坏血酸(ASA)的测定中,只要把上述的DTT和乙基马来酰亚胺用等体积的蒸馏水替代即可。以5%磺基水杨酸为溶剂,用同样的方法制作ASA标准曲线。

1.3.2DTNB-GR循环的动力学曲线的制作。取0.005Lg/LlGSSG(用5%磺基水杨酸配制)60Ll,用5%磺基水杨酸定容至100Ll,加入24Ll1.84mol/L三乙醇胺以中和样液,加入50Ll蒸馏水,加入706ml50mmol/L磷酸缓冲液,pH7.5,内含2.5mmol/LEDTA,加入20Ll10mmol/LNADPH和80Ll12.5mmol/LDTNB(二硫硝基苯甲酸),混匀,25℃保温10min,到时加入20Ll50U/mlGR,总体积为1ml,立即混匀,每[3]

[8]

隔30秒读出OD412值,共测定15min。

1.3.3GSH/GSSG测定。按照Nagalakshmi的方法,并作如下修改:取50Ll上清液,用5%磺基水杨酸定容至100Ll(即加入5%磺基水杨酸50Ll),加入24Ll1.84mol/L三乙醇胺以中和样液,加入50Ll10%乙烯吡啶(用70%乙醇配制),25℃水浴1h,以除去GSH,到时加入706ml50mmol/L磷酸缓冲液,pH7.5,内含2.5mmol/LEDTA,加入20Ll10mmol/LNADPH和80Ll12.5mmol/LDTNB(二硫硝基苯甲酸),混匀,25℃保温10min,到时加入20Ll50U/mlGR,总体积为1ml,立即混匀,读出3min时的OD值。此法用来测定GSSG,总的谷胱甘肽(GSH+GSSG)的测定,只要把上述的乙烯吡啶用等体积的蒸馏水替代即可。以5%磺基水杨酸为溶剂,用同样的方法制作GSSG标准曲线。

[4]

2　结果与讨论

在酸性条件下,ASA可把Fe3+还原为Fe2+,Fe与双吡啶形成红色络合物,此络合物在525nm处有最大吸收峰,以此来测定样品中的ASA和DAH含量。在测定样品中总的抗坏血酸含量(ASA+DHA)时,只要先在反应体系中加入过量的DTT,使DHA被完全还原为ASA。由于DTT也是一种强还原剂,可以把Fe3+还原为Fe2+,使测定结果便高。所以剩余的DTT一定要用过量的乙基马来酰亚胺除去,而乙基马来酰亚胺不影响测定结果。此时测出的就是样品中总的抗坏血酸含量。用总的抗坏血酸含量减去ASA含量,得到就是DHA含量。

在国内外的许多文献中,尚未见到用相同的提取系统——5%磺基水杨酸来同时提取和测定ASA/DHA和GSH/GSSG。文献中ASA的提取系统主要有2.5mol/L高氯酸、5%偏磷酸、10%三氯乙酸。我们用5%磺基水杨酸与文献报道的提取ASA/DHA的三种方法作了比较,得到图1的结果。从图中可以看出,用5%磺基水杨酸作提取系统,测定结果有较好的准确性、重复性和可比性。而用其它三种提取系统结果重复性较差,特别2+

第3期　　　　　　　李忠光等:　在单一提取系统中同时测定植物ASA/DHA和GSH/GSSG・69・

是用三氯乙酸作为提取系统,使ASA测定结果偏低,而DHA测定结果偏高,可能原因是ASA在三氯乙酸中容易被氧化或者说三氯乙酸不能有效地去除样品中的Fe,部分ASA被氧化为DHA。但总的抗坏血酸测定结果四种提取方法差异不大。因此,磺基水杨酸是ASA测定中较好的一个提取系统。

3+

循环是GR参与下的一个酶促反应过程。为了准确测定GSH/GSSG,必须制作DTNB——GR循环的动力学曲线,以确定最佳的时间参数。

图2　二硫硝基苯甲酸——谷胱甘肽还原酶循环Fig.2　5,5’-dithiobis-(-nitrobenzonic)——

GRrecycling

在DTNB——GR循环的动力学曲线制作时,在412nm处每隔30秒读一次OD值,得到图3DTNB——GR循环的动力学曲线。从曲线可以看出,在0—3min内,曲线呈严格的线性关系。因

图1　四种提取和测定方法的比较

Fig.1　Comparisonoffourmethodsofextraction

andmeasurement

此,在用DTNB——GR循环测定GSH/GSSG的过程中,反应的最佳时间参数为3min。

1摩尔GSH与1摩尔DTNB反应后,形成1摩尔的黄色产物——硫硝基苯甲酸,此物质在412nm处有最高吸收峰,因此在没有GSSG干扰的情况下,可根据硫硝基苯甲酸生成的量来计算GSH的量。在此反应中,GSH被氧化。但是如果在反应体系中加入供氢体NADPH和谷胱甘肽还原酶后,被氧化的谷胱甘肽又重新被还原为GSH,GSH再次与DTNB反应,从而形成图2的DTNB——GR循环,此循环也可以通过GR底物GSSG来启动。因此,利用DTNB——GR循环不仅可以测定GSH的含量,而且还可以测定GSSG的含量。在GSSH的测定中,预先在反应体系中加入过量的乙烯吡啶,乙烯吡啶可以分解GSH,从而消除GSH的干扰,而乙烯吡啶对测定结果无任何影响。这时,整个DTNB——GR循环仅仅在GSSG的推动下进行,故可以定量测定GSSG的含量。GSH和GSSG之和即为总的谷胱甘肽含量(GSH+GSSG)。此外,由于整个DTNB——GR图3　DTNB——GR循环的动力学曲线Fig.3　KineticcurveofDTNB——Grrecycling

H2O2可作为植物胞内氧化胁迫信号,启动多种抗氧化剂合成酶基因表达而提高抗氧化剂水平[2,5-6]。为检测我们这一提取和测定系统的有效性,我们检测了玉米幼苗在H2O2预处理后ASA和GSH的变化,得到图4的结果。从结果可以看出,H2O2预处理并恢复6h后,玉米幼苗中两种・70・

云南师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　第23卷

抗氧化剂ASA和GSH的水平都比对照高,分别高出了14%和20%,而总的抗坏血酸、总的谷胱甘肽、DHA和GSSG的含量变化不明显。

过DTNB——GR循环的动力学分析,使GSH/

GSSG测定中的时间参数得到了固定,使抗氧化剂的测定结果有较好的准确性、重复性和可比性。参　考　文　献:

[1]　李忠光,李江鸿,杜朝昆等.在单一提取系统中同时

测定五种抗氧化酶[J].云南师范大学学报(自然科学版),2002,22(6):44-48.

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[7]　刘家忠,龚明.植物抗氧化系统研究进展[J].云南师

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antioxidativesystemsofsuspension-culturedsoy-beacells(Glycinemax)inducedbyoxidativestress[J].PhysiolPlant.1996,97:388-396.

　　图4　H2O2处理后玉米幼苗ASA/DHA和GSH/

GSSG含量的变化

Fig.4　EffectofH2O2pretreatmentonASA/DHA

andGSH/GSSGinmaizeseedlings

综上所述,使用单一的抗氧化剂提取系统不仅使多种抗氧化剂的提取变得简便快速,而且通

SimultaneousmeasurementofASA/DHAandGSH/GSSGusing

asingleextractionsystem

LIZhongGuang,　DUChaoKun,　GONGMing

(SchoolofLifeScience,YunnanNormalUniversity,Kunming650031)

ABSTRACT:　Thispaperintroducedasingleantioxidantextractionsystem——5%sulphosalicylicacidwhichcouldextractandassayASA/DHAandGSH/GSSGsimultaneously.ThroughanalysisofkineticcurveofDTNB—GRrecycling,thesuitabletimeparameterwasselectedforthemeasurementGSH/GSSG.Thissystemmadetheextractionofantioxidantquickandeasy,andenhancedtheaccura-cy,reproducibilityandcomparabilityfortheantioxidantmeasurementthroughitcomparedtooriginalmethodofextractionandmeasurement.

KEYWORDS:　Singleextractionsystem;antioxidants;kineticsassay