蛋白酶提取、活力测定实验总结

发酵实验总结

生物技术1002 1610100311 刘小波

摘要：

1、实验目的：通过本次实验，学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法，学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术，了解碱性蛋白酶活力测定的原理，掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。

2、实验方法：从玉米黄顶菊混种土壤中筛选蛋白酶，之后经液体发酵扩大培养，挑选出活力较强的菌落，通过碱性蛋白酶活力测定的方法测出蛋白酶活力的大小。

3、实验结果：

实验原理：

1、能够产生胞外蛋白酶的菌株在平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的筛选依据。

2、蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可以利用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，先对分子质量较小的仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算酶的活力。

实验材料：

玉米黄顶菊混种土样、酪蛋白、牛肉膏、磷酸氢二钠、氯化钠、琼脂、蒸馏水、0.02mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.5）、1%酪蛋白溶液、5%三氯醋酸（TCA）溶液、烧杯、试管、容量瓶、量筒、玻璃棒、移液枪、电子秤、高温高压灭菌锅、恒温培养箱、离心机、水浴锅、紫外线分光光度计等。

实验方法：

蛋白酶的筛选：

1、准确称取玉米黄顶菊混种土样10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，用手震荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8一系列稀释菌液。

2、配酪素培养基（加琼脂），高压灭菌，倒平板，编号1、2、3。另外配不加琼脂的液体培养基，编号1、2、3。

3、取1的融入土壤的水1mL涂平板，置于恒温箱，于37℃或以上培养2～3天，挑选有水解圈（透明圈）的菌落。

4、液体发酵：挑去水解圈菌落，接种到液体培养基，恒温箱37℃培养2～3天，得酶原液。

注：酪素培养基成分：蛋白 10g 牛肉膏 3g 磷酸氢二钠 2g 氯化钠 5g 琼脂 15g 蒸馏水 1000mL pH7.4

制法：将除指示剂外的各成分混合，加热溶解(但酪蛋白不溶解)，校正pH。加入指示剂，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。用时加热溶化琼脂，冷至37℃，倾注平板。

蛋白酶活力测定：

1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。

2、取四支15ml具塞试管，分别标记A B C D,在A B 试管中各吸入0.20ml酶液，在C D试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/l磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。在B D试管中各吸入6.00ml 5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中恒温。

3、在各试管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在37℃保温10min后，再向A C试管中吸入6.00ml 5%三氯醋酸溶液。

4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，5000rpm离心10min，保留滤出液。

5、在280nm波长下，分别以 B D滤液为空白，测定A C滤液的吸光值。

结果分析：

建议感想：

经过本次历时一周多的发酵实验，我产生了很多的感悟想法。首先，这是我们上学这么年来第一次自己设计实验，自己动手配制实验药品，感觉自己收获最多的一次实验；第二，在查阅文献资料设计实验的过程中，自己第一次认真查阅并理解每一步骤的意义及其重要性，思考实验的可行性；第三、在实验过程中，自己独立操作了好多实验仪器，以前的专业技能训练内容终于派上了用场，弱弱的高兴自豪了一把；第四，在自主操作实验的过程中，每次离开实验室时，主动收拾用过的仪器，打扫实验室卫生，有种以实验室为家的感觉，这种感觉对我来说挺好，因为我以后打算工作的第一步以药厂实验员起步；最后，通过自己动手查阅文献、资料，自主设计操作实验流程，为以后科研查阅文献、资料、实验奠定了一定的基础。

至于建议，我认为：首先，咱们学校应该从大一开始就开展这样的实验，培养同学们自主查阅文献资料、动手做实验的能力，使同学们以后实验过程中形成正确的实验观；其次同学们在某些仪器的使用方法上仍然有些不足，在专业技能训练过程中应注重培养同学们实践动手操作能力，增加同学们使用重要仪器的机会；最后，同学们在实际操作过程中，仍有很多不规范操作，所以我认为我们以后应该增加实验课程，培养同学实践动手能力，为以后科研奠定一定的基础。